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內(nèi)參即是內(nèi)部參照（Internal control），是指在組織和細(xì)胞中表達(dá)相對穩(wěn)定的一類蛋白質(zhì)，通常由管家基因編碼。這些蛋白質(zhì)被用作檢測蛋白表達(dá)水平變化時(shí)的參照物，以確定實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

在Western Blot實(shí)驗(yàn)中，我們使用內(nèi)參其實(shí)就是使用與內(nèi)參對應(yīng)的抗體來檢測內(nèi)參的表達(dá)量。由于內(nèi)參在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)量相對穩(wěn)定，通過檢測每個(gè)樣品內(nèi)參的表達(dá)量，我們可以校正上樣誤差，從而獲得更可靠的半定量結(jié)果。使用內(nèi)參還可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全，并檢查該實(shí)驗(yàn)中的顯色或發(fā)光體系是否正常。通過選擇合適的內(nèi)參，可以將這些樣本之間的差異消除或最小化，減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。因此，選擇合適的內(nèi)參是Western Blot實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟之一。

根據(jù)所做的蛋白樣本的種屬確定，哺乳動(dòng)物一般β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Na+/K+-ATPase等；植物樣本一般選擇Plant actin、Rubisco等；其他來源樣本應(yīng)參考文獻(xiàn)報(bào)道選合適蛋白作為內(nèi)參。

根據(jù)研究對象的不同，選擇不同的內(nèi)參對于檢測細(xì)胞中不同位置的蛋白非常重要。一般情況下，選擇β-actin和GAPDH作為總蛋白的內(nèi)參就可以滿足要求。然而，對于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞膜等不同位置的蛋白檢測，我們需要選擇相應(yīng)的內(nèi)參，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有科學(xué)性和可靠性。常用內(nèi)參抗體分子量及其定位情況如下：

在選擇內(nèi)參抗體時(shí)應(yīng)考慮目的蛋白分子量大小，通常要求目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5kDa以上。例如，若檢測的目的蛋白分子量為45kDa，則不宜選擇分子量為42kDa的β-actin作為內(nèi)參，應(yīng)考慮選擇分子量為36kDa的GAPDH作為內(nèi)參。

在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，處理?xiàng)l件可能會(huì)影響一些內(nèi)參的表達(dá)，因此需要考慮研究的信號(hào)通路是否會(huì)對內(nèi)參的表達(dá)產(chǎn)生影響。例如，在糖代謝的研究中，不能使用GAPDH作為內(nèi)參，因?yàn)镚APDH是參與糖酵解過程中的酶，在某些細(xì)胞中，缺氧等條件會(huì)改變GAPDH的表達(dá)；在凋亡實(shí)驗(yàn)時(shí)，Lamin等也不適合作為內(nèi)參；在加入抗有絲分裂和抗真菌藥物時(shí)，Tubulin的表達(dá)易受影響，不適合作為內(nèi)參等。因此，在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案的時(shí)候應(yīng)考慮這些因素并參考相關(guān)文獻(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)過程中，還需要留意內(nèi)參表達(dá)是否出現(xiàn)異常等因素的考慮。