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技術(shù)專欄

PCR、qPCR、RT-PCR、Real-time PCR區(qū)別淺析

供稿：技術(shù)部

發(fā)布時間：2022-07-13

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PCR技術(shù)介紹：

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）是在體外酶促擴增特定DNA片段的技術(shù)，由美國Kary Mullis及其同事于1985年發(fā)明。熱穩(wěn)定性Taq DNA聚合酶的應(yīng)用和自動化裝置的發(fā)明與完善，使PCR技術(shù)進入實用階段。該技術(shù)的發(fā)明和廣泛應(yīng)用，大大推動了分子生物學(xué)各相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，發(fā)明者也因此獲得了1993年的諾貝爾化學(xué)獎。

隨著PCR技術(shù)的成熟，派生了不少相關(guān)技術(shù)。這類技術(shù)具有敏感、特異、快速和簡單等優(yōu)勢，在微生物檢驗中的應(yīng)用越來越廣，不少國家將其納入檢驗的標(biāo)準(zhǔn)方法；我國檢驗檢疫領(lǐng)域?qū)ζ鋺?yīng)用也日益擴大，國家要求市級以上疾病預(yù)防控制中心具有PCR檢測技術(shù)能力，用于突發(fā)公共衛(wèi)生事件的快速檢測和食品安全的有效監(jiān)管等。

PCR技術(shù)的基本原理和DNA在體內(nèi)天然復(fù)制過程相似，是在體外重復(fù)進行DNA模板解鏈、引物與模板DNA結(jié)合、DNA聚合酶催化形成新DNA鏈的過程，只是整個過程在體外進行，而且反應(yīng)體系比體內(nèi)更簡單。

1．體系組成和基本過程

（1）體系組成經(jīng)典PCR以DNA為模板，體系組成包括原始模板、引物、原料、DNA聚合酶以及合適的鹽、緩沖液以及溫度循環(huán)參數(shù)等。原始模板是指長的雙鏈DNA待擴增目的片段，微生物檢驗中往往是待測標(biāo)本中的DNA。引物是兩段單鏈寡核苷酸，其序列與待擴增片段的兩端分別相同和互補。原料則是4種脫氧核苷三磷酸。

（2）基本過程PCR基本過程分為變性、退火和延伸三個階段，經(jīng)過多次循環(huán)實現(xiàn)目的片段的擴增。變性是指將反應(yīng)體系混合物加熱至93℃~95℃，維持較短的時間，一般30s，使待測的雙鏈DNA在高溫作用下變性，解鏈為2條單鏈DNA模板的過程。退火是指將反應(yīng)體系混合物冷卻至特定溫度（也稱退火溫度）。延伸是指將反應(yīng)體系的溫度提高到72℃，在耐熱DNA聚合酶作用下，以4種脫氧核苷三磷酸為原料，按堿基配對原則，合成與兩條模板DNA互補的2條新的DNA鏈。

2．PCR技術(shù)的特點PCR技術(shù)顯著的特點，決定了其無論在生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究，還是在微生物檢驗方面，都具有很重要的地位。

（1）高靈敏度：產(chǎn)物量以指數(shù)方式增加，能將皮克（pg=10-12）量級的起始待測模板擴增到微克（μg=10-6）水平,能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞等等。

（2）高特異性：以堿基配對原則使引物與模板DNA特異正確的結(jié)合、DNA聚合酶合成反應(yīng)具有高度的忠實性、靶基因DNA具有高度特異性和保守性。

（3）方法簡便和快速：一次性加好反應(yīng)液，于DNA擴增儀進行變性-退火-延伸，2~4h完成擴增反應(yīng)；而且擴增產(chǎn)物易分析、無放射性污染、易推廣。特別是實時熒光定量PCR的發(fā)明和推廣，可以通過電腦實時監(jiān)控反應(yīng)進程，不需要再對產(chǎn)物進行檢測，大大縮短了實驗時間。

（4）對樣本的純度要求低及適用范圍廣：PCR技術(shù)對樣本的純度要求低，DNA粗制品可作為擴增模板；不一定需要分離病毒、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞；可直接用臨床血液、體腔液、洗漱液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等樣本的粗制DNA擴增檢測。適用范圍非常廣泛，不僅適合于微生物的快速檢測，還可用于臨床和法醫(yī)等各方面。

PCR的過程大致可分為3步：變性—退火—延伸。

變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

退火：（60℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

如下圖所示，在經(jīng)歷一次變性退火延伸的流程之后，原本只有1條的DNA雙鏈變成了2條；2次之后是4條；以此類推，只要經(jīng)歷幾十個循環(huán)數(shù)，就能產(chǎn)生大量的相同DNA片段。

PCR實驗流程示意

MINOR HEAT

后續(xù)檢測：

Endless Summer

以上就是常規(guī)PCR的正常流程。那在擴增完成之后我們需要對擴增出來的DNA進行檢測，常規(guī)的PCR技術(shù)通常只能借助凝膠電泳手段。這里不對電泳技術(shù)做過多介紹，其是根據(jù)DNA的分子量大小不同對DNA進行分離，從而進行鑒定以及純化DNA的技術(shù)。借助凝膠電泳可以判斷擴增出來的DNA片段條帶大小是否與目的條帶大小一致，從而知道是否得到了想要的產(chǎn)物；看是否有雜帶，判斷擴增是否具有特異性；看是否有引物二聚體判斷引物的設(shè)計好壞等等。

1關(guān)于qPCR和Real-time PCR：

很多人誤以為RT-PCR是Real-time PCR的縮寫，因此將二者混為一談，但實際上是不一樣的。

其實 Real-time-PCR 和 qPCR（Quantitative Rea-time-PCR）是一碼事，都是實時定量 PCR，指的是PCR 過程中每個循環(huán)都有數(shù)據(jù)的實時記錄，因此可以對起始模板數(shù)量進行精確的分析。

雖然 Real-time PCR（實時熒光定量 PCR）和 Reverse transcription PCR（反轉(zhuǎn)錄PCR）看起來都可以縮寫為 RT-PCR，但是，國際上的約定俗成的是：RT-PCR 特指反轉(zhuǎn)錄 PCR，而 Real-time PCR一般縮寫為 qPCR（quantitative real-time PCR）。在剛才介紹PCR后續(xù)檢測方法的時候，我們說了通常只能借助凝膠電泳去分析產(chǎn)物，但實時熒光定量PCR借助熒光化學(xué)物質(zhì)讓我們在PCR的過程當(dāng)中就可以檢測到DNA的擴增情況，從而不需要再去跑電泳了，極大的簡化了操作者的實驗步驟。

qPCR的實驗原理：

簡單來講，qPCR就是在整個擴增的過程中，引入了熒光基團，隨著DNA數(shù)量的成倍增加，反應(yīng)體系中的熒光信號也會增強。借助對熒光信號的強弱進行檢測，從而對DNA擴增的情況進行定量分析。

目前根據(jù)不同的熒光物質(zhì)，我們可以大致將qPCR分為兩種。一種是用熒光染料，主要為SYBRGreenⅠ染料，該染料能與DNA雙鏈結(jié)合，結(jié)合之后會顯示熒光信號，而在沒有結(jié)合的時候幾乎檢測不到熒光信號，隨著拷貝數(shù)的增加，熒光信號增強。而還有一種是使用熒光探針，又叫TaqMan探針法，其原理是根據(jù)目的基因設(shè)計一個能與之特異性結(jié)合的熒光探針，該探針包含兩個基團：一個熒光基團和一個淬滅基團，正常情況下因為淬滅基團的存在導(dǎo)致熒光基團無法發(fā)出熒光，而在擴增時探針結(jié)合到DNA的模板上，并且擴增到探針位置時兩個基團被切開，從而熒光基團可以發(fā)出熒光，同樣隨著拷貝數(shù)的增加，熒光信號增強。

TaqMan探針法原理圖

借助這種定量關(guān)系，人們可以繪制出PCR的擴增曲線，該曲線是熒光信號隨著循環(huán)數(shù)變化而變化的曲線，借助該曲線就可以對PCR的情況進行分析，理想的曲線應(yīng)該是呈現(xiàn)“S”型的增長，但是關(guān)于曲線分析的內(nèi)容比較復(fù)雜，在這里暫時不做過多贅述。至少我們知道借助該技術(shù)我們可以不用在每次做完P(guān)CR之后去辛苦的跑電泳，也可以更精確的分析我們的PCR結(jié)果。因此該技術(shù)被越來越廣泛的應(yīng)用。

另外值得一提的是，在疫情當(dāng)下，我們在做完核酸采樣之后到底如何去判定被檢者的陰性還是陽性，使用的便是qPCR技術(shù)，倘若在經(jīng)過擴增一定循環(huán)數(shù)之后能檢測到熒光信號，我們可認(rèn)為被檢者為陽性，反之則陰。

關(guān)于RT-PCR：

RT-PCR 就是逆轉(zhuǎn)錄 PCR（reverse transcription PCR）或者稱反轉(zhuǎn)錄 PCR（reverse transcription-PCR, RT-PCR），是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的一種廣泛應(yīng)用的變形。在 RT-PCR 中，一條 RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補 DNA，再以此為模板通過 PCR 進行 DNA 擴增。首先我們要清楚什么是反轉(zhuǎn)錄，我們一般將遺傳信息從DNA流向RNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄，反之，以RNA為模板合成DNA的過程我們稱為反轉(zhuǎn)錄。該技術(shù)的一般過程為，首先以RNA為模板在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成其對應(yīng)cDNA，再以cDNA為模板進行普通的PCR過程。歸根結(jié)底，其就是在PCR過程前加了一個反轉(zhuǎn)錄過程，那在這之后我們既可以用普通PCR手段，也可以采用qPCR進行擴增。比如病毒通常是以RNA為遺傳物質(zhì)，我們在進行病原體檢測的時候只能提取到它的RNA，所以是需要進行反轉(zhuǎn)錄的。

其它的PCR技術(shù)：

其實除了以上介紹的幾種PCR之外，現(xiàn)在還有數(shù)字PCR技術(shù)，也叫核酸分子絕對定量技術(shù)，相比于熒光定量，該技術(shù)更是對DNA數(shù)的絕對定量；以及巢式PCR等等。但其本質(zhì)都離不開最開始說的PCR的三個步驟。

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